盘点AAV空壳率的测定方法，打造一站式自主检测平台
2021年8月25日/医麦客新闻 eMedClub News/--近期，为实现AAV一站式自主检测，解决空壳率检测成本高、耗时长的问题，Optima AUC正式入驻宜明细胞，并开展AAV空壳率分析工作。分析型超速离心技术（Analytical Ultracentrifugation，AUC）将和宜明细胞原有的AEC-HPLC检测方法实现优势互补，打造业内高规格、类型全面的AAV空壳率检测方案集成平台。下面就目前常见的三种AAV空壳率检测方法进行简要介绍。
重组腺相关病毒（rAAV）是人类基因治疗一个颇有前景的工具。在rAAV的组装过程中，单链DNA (ssDNA)基因组被包装在衣壳蛋白内。由于包装效率低，组装后的衣壳大体分为三种：包含正确的DNA序列的完整衣壳（full capsid），包含截短的片段的部分完整衣壳（partial capsid），以及没有DNA的空衣壳（empty capsid）。这些衣壳不具有治疗功能，还会因其与完整衣壳竞争结合受体，增加了总体的病毒载量，也相应地增加了严重不良事件发生的可能性。为了保持生产过程的一致性，每批病毒载体的空/完整衣壳比例是关键的质量控制项目，监管机构强烈建议在整个生产过程中监控空壳比。
图一：rAAV生产过程中所产生的主要衣壳类型
但是如何测量空壳率/实心率不仅仅是AAV商业化生产的一个难点，也是药学研究一个难点。 目前可以表征空衣壳含量的方法包括透射电镜、离子交换色谱法、分析超速离心技术等进行检测。下文将简要介绍。
TEM的原理是利用加速电子束通过电磁透镜将穿透样品的电子（即透射电子）聚焦生成纳米级分辨率的图像。电镜通常使用阴性染色，染色后，观察对象为亮，背景为暗。对于rAAV (直径约25 nm)，样品图像中染色衣壳、部分染色衣壳和未染色衣壳分别代表空衣壳、部分完整衣壳和完整衣壳，并依赖于人工视觉识别进行量化。TEM属于实验室中测定空壳率的参考方法，也常常用于识别聚集物、变形衣壳和非衣壳颗粒（如宿主细胞碎片）。TEM一般只应用于纯化后的样品，因为细胞裂解液中存在的蛋白质和细胞碎片会干扰TEM图像中rAAV衣壳的准确识别。TEM的精度尚未得到全面评价。为了统计学的显著性，工作人员必须对数千个衣壳进行成像和分析，单个图像的衣壳含量变化约为2%。但是，TEM的结果时常不那么可靠，并且常与正交验证方法（如分析超速离心法，AUC)的结果不一致。其精确度不高的原因主要是样品染色模糊：颗粒部分填充以及染色不均匀会导致对比度低，以至于无法清晰识别各类衣壳亚种。
简言之，TEM作为工艺开发中的检测手段有以下的优势：多功能性，可检测含量比、聚集和纯度测定等指标；样品制备简单；可直接目视检测；然而，由于其低通量和高时间成本使其很难作为一种常规分析方法，而且TEM往往与其他正交分析方法的验证结果存在系统性不一致，这一点也必须加以研究解决。除TEM外，Cryo-EM也被用于检测含量比以及产品放行的检测。虽然有报道说TEM和Cryo-EM在测定含量比方面差别并不明显，但事实上Cryo-EM结果更可靠，可能因为TEM中常存在细胞碎片干扰和而且还有样品染色不均匀的困扰。另外商业化的低压TEM也越发引人关注，该仪器的自动图像分析时间缩短了大约6小时，而且标准化了大量衣壳分析。
AEC
阴离子交换色谱法（anion-exchange chromatography，AEC）可以用于多种血清型的空衣壳和完整衣壳的分离。因为不同的衣壳所包裹的基因组所带负电荷不同，导致不同衣壳间等电点的差异，AEC就是基于这一差异在正电荷固定相上进行样品的分离。目前AEC是在rAAV下游生产工艺中最为广泛使用的纯化方式之一，可应用于HPLC系统（需配备OD/FS检测器）以检测洗脱液的含量比。目前，空衣壳、部分完整衣壳和完整衣壳的基线分离仍未解决。
应用紫外检测器的AEC具有较高的重复性(<1%~4% CV)和中等精确度(2%~5% CV)，其准确性可以通过与TEM和AUC测试结果相比较来评估，但是受限于检测器的灵敏度，样品浓度不得低于1011 vg/mL。如果使用FS检测器的话，检测限则可以降低一个数量级。因此如果样品浓度足够的话，那么AEC的高通量和可重复性非常适于在工艺开发中常规使用。考虑到HPLC系统的可自动化以及非破坏性的性质，AEC-HPLC也是一种很有吸引力的在线仪器。
AUC
分析型超速离心技术（Analytical Ultracentrifugation，AUC）是表征生物大分子特性、研究生物分子理化性质的主要技术手段，也是目前能够精确表征AAV病毒颗粒特性，测定聚合物，量化空衣壳、部分完整衣壳和完整衣壳的相对含量的重要手段之一。AUC可以通过紫外线吸收或Raleigh干涉实时扫描离心过程中样品分布状态，通过分析其随时间的变化过程，以计算出不同组分的沉降性质。然后再依据空壳病毒与全病毒颗粒沉降系数的不同，精确地测定出AAV载体的空壳率，同时可以检测中间产物、病毒载体碎片、基因组碎片、病毒聚集体等。AUC在定量含量比方面有两个优势，一是可重复性高，变异系数（coefficient of variation，CV）仅为2%；二是AUC可有效地区分部分完整衣壳、空衣壳和完整衣壳。AUC已成为目前检测AAV病毒载体空壳率的最为精准技术手段，被业内人士广泛认可。但是AUC也有自身的限制。 首先只能用于无残留杂质或赋形剂的纯化样品。其次而且受限于检测器的灵敏度，检测样品用量较大，上样量在400-500ul，OD230 0.4到1.2之间，这在生产的早期阶段无疑是不小的损失。另外AUC测试的用时较长，通常在6小时左右，而且每次只能测试3个或者7个样品，因此在工艺开发过程中常规使用AUC也是极具挑战性的。
但是事实上，AUC非常适合作为正交方法来验证其他更快但是分辨率较低的方法，比如AEC。在宜明细胞，我们正是应用AEC-HPLC，电镜以及AUC多种方法相互验证的检测方案，以确保出品高品质AAV载体。近期宜明细胞斥资引进Optima AUC，搭建了AUC和HPLC检测平台，全面提高空壳率方法学验证能力和放行检测的速度，同时也可以为业内类似产品提供检测服务，助力基因治疗产业快速发展。
综上所述，每种量化含量比的方法都要在通量和分辨率之间进行权衡。在快速的高通量方法中，AEC是最具前景的。TEM则可以提供更直观的数据。在高分辨率的方法中，AUC独领风骚，可提供高分辨率AAV样品分析信息，可实现定量鉴别空心、实心及聚集体。在宜明细胞，三种检测方法相互结合参照验证，全面表征AAV产品，确保高品质AAV产品的持续稳定供应，让更多患者获益。
Ubrigene， Serve with Hearts！
Ref：
1.https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.02.010
2.https://sciex.com/content/dam/SCIEX/pdf/tech-notes/all/AAV-Full-Partial-Empty.pdf
3.https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.04.003
4.https://resources.mybeckman.cn/learningcenter/campaign/detail/c1016/
5.http://beckman.cnpowder.com.cn
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